Modelli preclinici non convenzionali
DALLA PROOF OF CONCEPT AGLI ASPETTI REGOLATORI: VANTAGGI, LIMITI ED APPLICABILITÀ
Le nuove regole globali e una maggiore coscienza etica implicano controlli sempre più rigorosi sull’impiego dei vertebrati negli studi in vitro. Ciò ha fatto lievitare i costi e i tempi necessari per ottenere le autorizzazioni. Ciononostante non tutti gli studi possono essere effettuati in vitro. Negli ultimi anni sono stati proposti nuovi modelli alternativi per es. insetti e gasteropodi utili in campo microbiologico, per lo studio del rapporto ospite-parassita, alcuni aspetti della immunità innata, per lo screening dei farmaci antimicrobici e per un primo screening tossicologico.
Tenebrio molitor
La larva di Tenebrio molitor, comunemente conosciuta come “tenebrione dei cereali”, costituisce un modello animale alternativo di crescente interesse nella ricerca preclinica, in particolare nel contesto delle interazioni ospite-patogeno. Questo interesse deriva dalla sua idoneità come modello di studio, caratterizzato da un sistema immunitario in grado di rispecchiare alcune dinamiche presenti nei mammiferi, e da una serie di vantaggi pratici e economici.
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Le larve di Tenebrio molitor presentano un sistema immunitario complesso e dinamico, caratterizzato da una risposta sia umorale che cellulare. La presenza di peptidi antimicrobici nelle larve offre un parallelo interessante con la risposta immunitaria innata dei mammiferi, contribuendo alla loro utilità come modello sperimentale.
La gestione delle larve è agevolata dalle loro dimensioni adeguate, consentendo iniezioni precise di sostanze da testare senza la necessità di anestesia, e facilitando la manipolazione e la raccolta di tessuti ed emolinfa per analisi dettagliate, come la proteomica.
Dal punto di vista pratico, l’allevamento delle larve è relativamente semplice ed economico, con una disponibilità commerciale diffusa a livello globale. Questo aspetto rende le larve di Tenebrio molitor accessibili a un’ampia comunità scientifica e li rende una risorsa preziosa per la ricerca preclinica.
Un vantaggio significativo di questo modello è la sua breve durata del ciclo vitale, che consente di ottenere risultati rapidamente, contribuendo a ridurre i tempi e i costi della ricerca. Inoltre, la sopravvivenza delle larve a una gamma di temperature permette di studiare le interazioni ospite-patogeno in condizioni che riflettono più da vicino l’ambiente fisiologico umano.
L’adozione sempre più diffusa delle larve di Tenebrio molitor come modello di studio per microrganismi patogeni umani è stata accompagnata dalla scoperta di nuovi peptidi antimicrobici e inibitori dei fattori di virulenza, suggerendo potenziali applicazioni terapeutiche in futuro.
Bibliografia
Petronio Petronio G, Pietrangelo L, Cutuli MA, Magnifico I, Venditti N, Guarnieri A, Abate GA, Yewhalaw D, Davinelli S, Di Marco R. Emerging Evidence on Tenebrio molitor Immunity: A Focus on Gene Expression Involved in Microbial Infection for Host-Pathogen Interaction Studies. Microorganisms. 2022 Oct 7;10(10):1983. doi: 10.3390/microorganisms10101983. PMID: 36296259; PMCID: PMC9611967.
Lozoya-Pérez NE, García-Carnero LC, Martínez-Álvarez JA, Martínez-Duncker I, Mora-Montes HM. Tenebrio molitor as an Alternative Model to Analyze the Sporothrix Species Virulence. Infect Drug Resist. 2021 Jun 3;14:2059-2072. doi: 10.2147/IDR.S312553. PMID: 34113132; PMCID: PMC8184153.
Galleria mellonella
La larva del lepidottero Galleria mellonella è ad oggi ampiamente utilizzata nella ricerca pre-clinica come modello animale alternativo ai mammiferi. Le ragioni del suo successo risiedono sia nelle numerose similitudini con i modelli “standard” come ad esempio la presenza di un sistema immunitario di tipo umorale e cellulare, sia nelle caratteriste peculiari di questa specie come la dimensione delle larve, la facilità di allevamento e la capacità di sopravvivere anche a 37°C.
- Petronio Petronio, G., Cutuli, M. A., Magnifico, I., Venditti, N., Pietrangelo, L., Vergalito, F., … & Di Marco, R. (2020). In Vitro and In Vivo Biological Activity of Berberine Chloride against Uropathogenic E. coli Strains Using Galleria mellonella as a Host Model. Molecules, 25(21), 5010.
- Venditti, N., Vergalito, F., Magnifico, I., Cutuli, M. A., Pietrangelo, L., Cozzolino, A., … Petronio Petronio, G. & Di Marco, R. (2020). The Lepidoptera Galleria mellonella “in vivo” model: a preliminary pilot study on oral administration of Lactobacillus plantarum (now Lactiplantibacillus plantarum). The new Microbiologica, 44(1).
- Cutuli, M. A., Petronio Petronio, G., Vergalito, F., Magnifico, I., Pietrangelo, L., Venditti, N., & Di Marco, R. (2019). Galleria mellonella as a consolidated in vivo model hosts: new developments in antibacterial strategies and novel drug testing. Virulence, 10(1), 527-541.
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- Galleria mellonella (“tarma maggiore della cera”) fa parte della sottofamiglia delle Galleriinae appartenente alla famiglia Pyralidae dei lepidotteri. Vive negli alveari, nutrendosi di cera e polline. Il suo ciclo vitale è di circa 7-8 settimane e si compone di diverse fasi: l’uovo, la larva che subisce 6 fasi larvali prima del raggiungimento dell’ultimo instar che richiede circa 5-6 settimane a una temperatura compresa fra 25°-28°C, la pupa (crisalide) ed infine, dopo ulteriori due settimane l’adulto. Le larve si sviluppano dall’uovo in circa cinque settimane ed hanno una lunghezza compresa tra 2 e 2,5 cm con un colore crema.
Come modello alternativo ai mammiferi, le larve presentano numerosi vantaggi per la ricerca pre-clinica, lo studio delle interazioni ospite-patogeno, lo screening di tossine e studi di tossicità. Tra questi riscontriamo la presenza di un sistema immunitario di tipo umorale e cellulare, inoltre sono presenti peptidi antimicrobici, simili a quelli riscontrati nell’attivazione del sistema immunitario innato dei mammiferi. Infine, gli emociti costituiscono i maggiori mediatori della difesa cellulare con funzioni sovrapponibili a quelle dei macrofagi e neutrofili umani.
Le grandi dimensioni delle larve di G. mellonella permettono una precisa iniezione, senza necessità di anestesia farmacologica, di sostanze da testare (come ad esempio antibiotici, sostanze chimiche e agenti patogeni), facile manipolazione e raccolta dei tessuti ed emolinfa che consentono lo studio della fisiopatologia attraverso, ad esempio, approcci di proteomica. Tutto ciò si somma ai bassi costi complessivi dell’allevamento anche di grosse dimensioni, che fornisce un sistema sperimentale ad alto rendimento ed economico. La loro disponibilità commerciale si espande a livello mondiale. Sono vendute, ad esempio, come esca per la pesca sportiva, come cibo per gli animali domestici. Per tali ragioni sono economiche, di facile reperibilità e non richiedono attrezzature e locali speciali come gli stabulari utilizzati per l’allevamento dei mammiferi.
Inoltre, l’uso di G. mellonella non richiede l’approvazione etica e grazie alla breve durata del loro ciclo vitale è anche possibile effettuare studi ed ottenere risultati rilevanti in periodi brevi permettendo di abbattere i tempi e conseguentemente i costi della ricerca. Infine, a differenza di altri modelli di invertebrati come Caenorhabditis elegans e Drosophila melanogaster, G. mellonella è in grado di sopravvivere a 37°C, permettendo quindi di mimare le condizioni simili alla fisiologia umana. Di fatto, gli agenti patogeni umani si sono evolutivamente adattati alla temperatura fisiologica del loro ospite, per la sintesi e la liberazione dei fattori di virulenza. Questo rende G. mellonella un modello idoneo per lo screening delle interazioni ospite-patogeno temperatura dipendenti.
Questi vantaggi hanno convinto un numero sempre maggiore di ricercatori ad avvalersi delle larve di G.mellonella come modello mini-host per i microrganismi patogeni per l’uomo quale il Bacillus cereus, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Escherichia coli etc… Inoltre, nel corso degli ultimi dieci anni, in G.mellonella sono stati scoperti diversi peptidi antimicrobici e inibitori dei fattori di virulenza, il cui potenziale terapeutico nella medicina e nella protezione delle piante è attualmente in fase di sperimentazione.
Limacus flavus
Limaccia usata per lo Slug mucosal assay
Principali caratteristiche che rendono la mucosa delle lumache sovrapponibile alle mucose umane:
- Mucosa morbida e non cheratinizzata
- L’epitelio esterno è a singolo strato costituito da cellule epiteliali con microvilli e da cellule ghiandolari che secernono muco.
Punti di forza del modello:
- Vantaggi rispetto ai saggi di tossicità condotti in vitro
- Readouts facilmente osservabili
- Vantaggio bioetico
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Slug mucosal assay
Le mucose orali, nasali, oculari, genitali e rettali, sono barriere naturali che hanno una cruciale funzione protettiva, prevengono l’ingresso di microorganismi e di sostanze nocive dall’ambiente all’interno del nostro organismo. Questi epiteli possono essere esposti a farmaci, medical device, presidi medici chirurgici e cosmetici inducendo potenziali irritazioni e microlesioni che aumentano la suscettibilità alle infezioni.
Test sulla tossicità dei farmaci e studi di biocompatibilità sono strumenti fondamentali per la selezione, lo sviluppo e l’immissione in commercio di farmaci e medical device.
Un modello alternativo in vivo per la valutazione della tossicità mucosale di sostanze chimiche e formulazioni è rappresentato dal saggio Slug mucosal Irritation (SMI).
Le lumache, molto sensibili alle sostanze chimiche, producono muco se esposte a sostanze irritanti. Il danno tissutale può essere stimato in base alla produzione di muco, alla variazione del peso corporeo, al rilascio di proteine ed enzimi dalla parete del corpo delle lumache.
La specie di lumaca Arion lusitanicus è stata il primo invertebrato utilizzato come alternativa ai modelli mammiferi per studi di tossicologia mucosale. Le lumache possiedono un tessuto mucoso, simile a quello umano, che può essere facilmente osservato essendo all’esterno dell’organismo. La parete corporea è morbida, non cheratinizzata e comprende un epitelio esterno monostratificato composto da cellule non ciliate con microvilli e cellule ghiandolari secernenti muco.
Numerosi studi che utilizzano le lumache come modello di mucosa sono stati pubblicati su riviste scientifiche internazionali peer review. L’elevata predittività dell’SMI assay è stata dimostrata anche in studi di comparazione con il modello di mucosa di coniglio dove sono stati osservati risultati sovrapponibili tra i due differenti test.
Presso il nostro laboratorio abbiamo messo a punto un saggio di tossicità mucosale utilizzando la lumaca Limacus flavus. Questa specie si è rilevata una valida alternativa all’A. lusitanicus nel discriminare il potenziale di irritazione mucosale dei più comuni disinfettanti utilizzati per contrastare la diffusione del SARS-CoV-2. Visti i promettenti risultati ottenuti e l’elevata traslabilità clinica, questo modello può essere applicato anche per lo screening tossicologico mucosale di formulazioni farmaceutiche ad uso topico, medical device e cosmetici.
Bibliografia
M. A. Cutuli; A. Guarnieri; L. Pietrangelo; I Magnifico; N. Venditti; L. Recchi; K. Mangano; F. Nicoletti; R. Di Marco; and G. Petronio Petronio). Potential Mucosal Irritation Discrimination of Surface Disinfectants Employed against SARS-CoV-2 by Limacus flavus Slug Mucosal Irritation Assay. Biomedicines, 2021, 9(4), 424.
Dhondt, M. M., Adriaens, E., Pinceel, J., Jordaens, K., Backeljau, T., & Remon, J. P.. Slug species-and population-specific effects on the end points of the Slug Mucosal Irritation test. Toxicology in vitro, 2006, 20(4), 448-457.
Lenoir, J.; Bachert, C.; Remon, J.-P.; Adriaens, E., The slug mucosal irritation (SMI) assay: A tool for the evaluation of nasal discomfort. Toxicology in Vitro 2013, 27, (6), 1954-1961.
Kendall, R.; Lenoir, J.; Gerrard, S.; Scheuerle, R. L.; Slater, N. K.; Tuleu, C., Using the Slug Mucosal Irritation assay to investigate the tolerability of tablet excipients on human skin in the context of the use of a nipple shield delivery system. Pharmaceutical research 2017, 34, (4), 687-695.
Adriaens, E.; Guest, R.; Willoughby Sr, J.; Fochtman, P.; Kandarova, H.; Verstraelen, S.; Van Rompay, A., CON4EI: Slug Mucosal Irritation (SMI) test method for hazard identification and labelling of serious eye damaging and eye irritating chemicals. Toxicology in Vitro 2018, 49, 77-89.
